骨肉瘤自殺基因
自殺基因治療是將某些細菌、病毒和真菌中特有的藥物敏感基因導入腫瘤細胞，通過此基因編碼的特異性酶類將原先對細胞無毒或抑制作用極低的藥物前體在腫瘤細胞內代謝成有抑制作用的產物，通過抑制核酸合成達到殺死腫瘤細胞的目的。1999年，Grossin等［1］將單純皰疹病毒載體-胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因（herpessimplexvirusthymidineki-nase，HSV-TK）轉染入人骨肉瘤細胞株后發現其對丙氧鳥苷（ganciclovir，GCV）異常敏感。隨后，charissoux等［2］又做了體內實驗，他們將小塊骨肉瘤組織種植在兔脛骨的旁邊，7d后向腫瘤組織內注射包裝細胞，隨后使用GCV治療。結果顯示本該在這一時間發生腫瘤肺臟轉移的兔卻安然無恙，同時發現腫瘤體積較以前減小了。這些研究表明，自殺基因對于骨肉瘤的治療有著潛在的價值。近幾年，人們針對骨肉瘤及其肺轉移的基因治療研究中已經在免疫基因治療、反義基因治療、抑癌基因治療、自殺基因靶向治療等多種基因治療方面取得了一定進展。自殺基因治療因為具備特有的旁觀者效應，而骨肉瘤的基因治療目前面臨的最大問題就是轉染率低，這使得自殺基因治療成為一種極富前景的治療方法，近幾年在這方面的研究取得許多可喜成果，現綜述如下。
1自殺基因治療系統的研究
自殺基因治療系統是由特定的自殺基因聯合特定的前藥組成，不同的治療系統表現出不同的治療特性，同一種治療系統隨腫瘤種類、性質的不同又表現出不同的細胞抑制作用和旁觀者效應。在對特定的腫瘤治療中選擇對應性好的自殺基因治療系統，不僅對腫瘤組織的殺傷性好，且能較好地保護正常組織。目前，已經運用到骨肉瘤試驗性治療的自殺基因治療系統且取得一定進展的有以下幾個。
1.1HSV-TK/GCV系統HSV-TK在自殺基因治療中是研究最多的，常用的前體藥物是GCV。TK基因編碼的胸苷激酶可將GCV代謝為二磷酸化物，二磷酸化物在細胞內酶的作用下成為有抑制作用的三磷酸化物，后者通過抑制DNA聚合酶活性，阻止DNA復制，從而殺死腫瘤細胞。Seto等［3］將HSV-TK基因轉染骨肉瘤細胞株LM8后，發現GCV對于導入HSV-TK的細胞株的細胞抑制作用更加敏感，而且在體內試驗中觀察到明顯的腫瘤生長抑制和肺轉移抑制。Zheng等［4］進一步利用直接轉運核苷激酶蛋白到骨肉瘤細胞中來觀察它的治療作用，結果發現骨肉瘤細胞株經酶―脂質混合物處理后對GCV的敏感性增強。這樣的結果說明直接轉染自殺基因蛋白是一種新的替代傳統的基因治療方法。雖然骨肉瘤已經被證實是HSV-TK/GCV自殺基因治療的潛在靶標，但是HSV-TK/GCV系統在骨肉瘤治療中的應用仍沒有得到全面的認識。Ketola等［5］研究結果進一步證實:a）骨肉瘤細胞能夠被腺病毒或慢病毒介導的基因轉染;b）骨肉瘤細胞株是HSV-TK/GCV基因治療良好的靶標;c）HSV-TK/GCV對細胞的抑制作用的程度與旁觀者效應有相關性。
1.2CD/5Fc系統大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase，CD）催化胞嘧啶脫氨基生成尿嘧啶，使低抑制作用的5氟胞嘧啶（5cytosineuracil，5FC）變成了強抑制作用的化療劑5氟尿嘧啶（5fluorineuracil，5FU），5FU代謝生成5-氟磷酸脫氧尿苷，通過阻止脫氧尿苷生成脫氧胸腺嘧啶核甙三磷酸酯而抑制DNA的合成。Ramnaraine等［6］應用鼠科2472株骨肉瘤細胞轉染帶有細菌或真菌基因的神經生長因子受體與胞嘧啶脫氨酸的融合基因（nervegrowthfactorre-ceptorandcytoplasmicCDfusiongenescontainingeitherthebacterialoryeast，NGFR-bCD或NGFR-yCD），在體外實驗中，5FC通過直接和旁觀效應能夠殺死這種被轉染的細胞;相比之下，5FC用于治療皮下分別種植NGFR-bCD和NGFR-yCD腫瘤的實驗鼠結果顯示僅對種植NGFR-yCD腫瘤有影響。用5FC治療骨肉瘤，不僅可消除腫瘤，還能有效抑制腫瘤誘導的骨破壞并使得破骨細胞的數量減少，CD/5Fc系統以及黑腹果蠅DNA激酶（DrosophilamelanogasterDNAkinase，Dm-dNK）作為自殺基因在骨肉瘤的聯合基因治療和化學基因治療中也得以應用［7］。
1.3Dm-dNK/BVDU系統Zheng等［8］用反轉錄病毒轉導Dm-dNKcDNA到骨肉瘤細胞中，發現轉導后的細胞能夠表達有活性的酶，和前藥溴乙烯脫氧尿苷（bromovinylde-oxyuridine，BVDU）一起作用能夠產生細胞抑制作用，而且表明BVDU被Dm-dNK磷酸化后也能引起旁觀者效應。
1.4CE2/CPT-11系統Oosterhoff等
［9］利用人肝羧酸酯酶-2（carboxylesterase-2，CE2）和抗癌因子喜樹堿-11（camp-tothecin-11，CPT-11）來觀察其對于骨肉瘤的治療作用。CPT-11是一個在臨床上已經得到證實的前藥，能夠在CE2作用下轉化成有活性的乙羥基喜樹堿（7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin，SN-38）。體外試驗中，轉導包含編碼分泌型CE2的腺病毒載體（adenoviralvectorcantainingthecDNAencodingasecretedformofCE2，Ad-sCE2）的骨肉瘤細胞株對于CPT-11治療的敏感度是未轉導的2800倍;取自骨肉瘤病人的瘤細胞經短期培養后接受CPT-11治療，轉導Ad-sCE2細胞的敏感度是未轉導的70倍。當試驗鼠皮下接種骨肉瘤細胞株OSMG-63后，在腫瘤中注射Ad-sCE2和CPT-11，相比較單獨注射Ad-sCE2或CPT-11而言，腫瘤的生長明顯受到抑制。
2替代性前藥的研究
GCV的三環類衍生物已經被證實對于骨肉瘤HSV-TK基因轉導是一系列潛在的、高選擇性的細胞抑制性前藥，盡管它們對于HSV-TK的親和力弱于GCV，但對于細胞抑制的能力和選擇性則等同于GCV，而且在細胞培養中亦呈現出顯著的旁觀者效應。與GCV不同的是:三環類嘌呤衍生物具有內在的強熒光結構，這使得能夠在生物組織和液體中對其進行簡便和靈敏的檢測;此外，它們的親脂性遠強于GCV，更易于進入含脂類高的組織中去［10］。
5-碘嘧啶核苷作為基因治療的前藥應用于沒有TK轉導和有TK轉導的骨肉瘤細胞株，結果顯示:5-碘復合物比GCV更能有效抑制有TK轉導的細胞的生長，而對于沒有TK轉導的細胞則比GCV的抑制作用弱［11］。
碘乙烯化去氧氟核糖尿嘧啶（iodovinyldeoxyfluorori-bofuranosyluracil，IVFRU）是一種有選擇性地增強鼠科骨肉瘤細胞株表達HSV-TK的嘧啶核苷酸類似物。Morin等［12］在人骨肉瘤細胞攝取［I-125］IVFRU的研究中發現IVFRU相比較于GCV對于表達HSV-TK的細胞株表現出較低的細胞抑制作用;此外，IVFRU在亞細胞核酸部分分布的差異以及對細胞抑制的差異使得IVFRU能反映出細胞類型和譜系。
3腫瘤特異性啟動子聯合自殺基因的研究
如果在自殺基因前端接上一個腫瘤特異性的啟動子，可以使自殺基因呈腫瘤特異性表達，以此來增強自殺基因對腫瘤細胞的殺傷效力以及降低它的系統抑制作用。
骨鈣蛋白在成骨性骨肉瘤中高表達，具有特異性，因此，一些學者采用骨鈣蛋白啟動子聯合自殺基因來治療骨肉瘤。Ko等［13］重組腺病毒-骨鈣蛋白啟動子-胸腺嘧啶激酶（aden-ovirus-osteocalcin-thymidinekinase，Ad-OC-TK）在體外轉染人骨肉瘤細胞、體內轉染鼠骨肉瘤細胞，均發現高選擇性阻斷腫瘤細胞生長。cheon等［14］也采用Ad-OC-TK方法，同時結合化療治療鼠骨肉瘤模型，發現化學基因治療組存活率明顯提高。Shirakawa等［15］通過靜脈注射Ad-OC-TK、腹腔注射無環鳥苷（acyclovir，ACV）的方法治療鼠骨肉瘤，亦觀察到明顯的抑瘤效應，并提示Ad-OC-TK/ACV可以用于骨肉瘤肺轉移的系統治療。
Chen等［16］則采用包含編碼TK基因和T7自主基因的非病毒載體T7、聯合T7啟動子及T7RNA聚合酶同時導入人骨肉瘤細胞系，90%以上的腫瘤細胞在4d內被GCV殺死。Majumdar等［17］采用人端粒酶逆轉錄酶啟動子-TK基因（humantelomerasereversetranscriptasepromotor/TK，hTERTp/TK）和巨細胞病毒啟動子-TK基因（cy-tomegaloviruspromoter，CMVp/TK）分別轉染人OS143B細胞株，使用GCV獲得相近的腫瘤消退和生存率，并且hTERTp啟動子表現出很強的腫瘤特異性，在健康組織和器官中未檢見自殺基因的表達。
葡萄糖調節蛋白-78（78-KDAglucose-regulatedpro-tein，GRP78）是一種在變異細胞和血供差的瘤組織中處于糖饑餓、酸毒癥和缺氧狀況下的細胞中過渡表達的壓力應激蛋白，其中有抗凋亡結構。已經證實GRP78啟動子可以通過激活HSV-TK自殺基因的表達來消除腫瘤。在逆轉錄酶病毒載體中，Dong等［18］觀察到GRP78啟動子驅動的自殺基因在骨肉瘤中強烈表達。在轉基因鼠模型中，GRP78啟動子激活基因在主要的成年器官中是靜止的，但是在腫瘤細胞中和腫瘤相關的巨噬細胞中非常活躍，它能夠擴散到腫瘤因缺血發生壞死的部位中并能有助于以細胞為基礎的治療。這樣，通過應用GRP78啟動子的轉錄控制為腫瘤的基因治療提供多種新的方法。
4旁觀者效應的研究
國內外所有HSV-TK研究者在實踐中均發現HSV-TK系統不僅具有直接細胞殺傷作用，還具有明顯的旁觀者效應。這一效應有力地增強了HSV-TK系統的作用，有些甚至只需要1%～5%的轉染細胞即可引起幾乎全部瘤細胞死亡。
關于旁觀者效應的機制，一般認為是GCV的磷酸化產物擴散至周圍的腫瘤細胞而產生。Freeman等［19］認為HSV-TK陽性細胞形成的“凋亡小體”被周圍的HSV-TK陰性細胞攝取或細胞間通過縫隙連接進行胞質交換，使HSV-TK陰性細胞死亡。Yang等［20］認為旁觀者效應的程度與間隙連接細胞間通訊（gapjunctionalintercellularcomminication，GJIC）有關。Mesnil等［21］總結了GJIC在旁觀者效應中的作用，發現無論是體內還是體外，GJIC表達的高低與潛在的旁殺傷作用之間具有直接的相關性，特別是在使用HSV-TK/GCV作為自殺基因系統的情況下更是如此。此外，由于腫瘤的發生與其逃避機體免疫監視有關。動物實驗發現HSV-TK陽性腫瘤細胞被GCV殺傷后，可以引起壞死組織周圍大量巨噬細胞和CD4+、CD8+T淋巴細胞的浸潤，強烈炎癥反應可引起抗腫瘤免疫性殺傷。這可能也是旁觀者效應的機制之一。