作者：王寧寧，張玉鳳，張紅霞，譚金鳳，謝洪哲，姚書忠，莊廣倫，牛剛，黃建昭，何勉
探討子宮內膜異位早期種植的相關基因，特別是與早期種植相關的血管生長基因。采用裸鼠人子宮內膜皮下種植的方法，建立裸鼠人子宮內膜異位癥模型，在種植后14d，取出成模病灶與未種植內膜進行CSC-GE-80基因芯片篩查比較。在基因表達譜中最有顯著性上調基因50個，最有顯著性下調基因47個，包括生長因子和細胞因子及其受體的變化，其中生長因子受體結合蛋白10（growthfactorreceptor-boundprotein10，Grb10）與丁酸鹽反應因子1（butyrateresponsefactor1）中表皮生長因子（EGF-responsefactor1）上調明顯，下調明顯胰島素樣生長因子結合蛋白7（insulin-likegrowthfactorbindingprotein7）。通過基因篩查我們初步考慮生長因子結合蛋白10（growthfactorreceptor-boundprotein10）有可能參與早期異位內膜的血管生長。
子宮內膜異位癥；早期種植；裸鼠模型；基因芯片；血管生長
子宮內膜異位種植的原因，一直是人們是人們關注的熱點。在我們前期的研究中，通過裸鼠進行人子宮內膜的異體異位種植，我們發現血管生成及其相關因子如血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）在異位內膜的早期種植與生長的過程中，起十分重要的作用[1,2]。但子宮內膜異位種植的早期，究竟是哪些基因發生變化或者在這一過程中起到作用，仍不十分清楚。我們擬通過基因芯片篩查種植在裸鼠的人子宮內膜異位病灶，為早期的種植相關基因提供了一定的理論依據。
1材料與方法
1．1實驗動物
由中山大學實驗動物中心提供SPF級飼養BALB/c裸鼠,雌性,體質量17~21g,實驗過程飼養在清潔環境，（溫度：22～24℃，濕度：45%～70%，12h黑白交替），每1只放1籠，共5只，飼養予以滅菌的水與飼料，每周添加雞蛋、葵花籽以增加蛋白質等營養的攝入。
1.2人子宮內膜組織的獲取
子宮內膜取自子宮腺肌癥伴盆腔子宮內膜異位癥患者2例，年齡分別為43與47歲。手術前6個月未進行激素類藥物治療，在進行全子宮切除后立即進行內膜組織的刮取，種植前部分內膜進行HE染色組織病理分析。取材后將內膜無菌保存在德氏改良基礎培養基（Dulbcco′smodifedeaglemedium，DMEM）培養液中，一部分剪成3mm×3mm大小，另一部分繼續剪成0.5mm×0.5mm碎屑液,診刮后60min內完成皮下種植術。兩例患者術后病理均提示子宮腺肌癥，分泌期子宮內膜。
1.3BALB/c裸鼠人子宮內膜異位癥的模型建立
詳細方法參照參考文獻[1]進行,子宮內膜裸鼠皮下異位種植14d成模后取出進行檢測。
1.4主要試劑
Cy3熒光素標記的單克隆抗α-平滑肌肌動蛋白抗體（Cy3conjugatedmonoclonalanti-α-smoothmuscleactinclone,1∶400）購自英國Sigma公司；FITC熒光素標記單克隆羊抗兔抗體（1∶200）購自購自美國SantaCruz公司。DMEM培養液購自GiBco公司。TrizolReagent購自LifeTechnologies公司。QiageneRT-PCR、Qiagene快速PCR純化試劑盒購自Qiagene公司。AmbionmessageAmpaRNA試劑盒購自Ambion公司。CyScribecDNA熒光標記試劑盒購自Amersham生物制藥技術有限公司。基因表達譜芯片CSC-GE-80由深圳微芯公司提供。
1.5種植病灶的基因芯片檢測
1.5.1總RNA提取保護液中保存的小塊新鮮組織采用Trizol的方法進行提取與微量擴增、純化，把所得到的cDNA真空抽干至體積小于8μL，并保存在-20℃。接著RNA的擴增aRNA的純化參照試劑盒進行,將aRNA樣品于-80℃存放，取5～20μg進行反轉錄標記。
1.5.2探針標記與芯片雜交探針標記采用aRNA10μg,secondroundprimer1μL,SpikeRNA2μL,DEPCwater加至10μL,70℃5min變性，然后冰上冷卻后，采用Buffer4μL,0.1mol/LDTT2μL,dNTPmix1μL,dye-dCTP1μL,RibonucleaseInhibitor1μL,RT1μL,42℃連續2h,反應完畢后，用2μL0.5mol/LNaOH,處理后，然后用將pH值調為中性。采用QIAquickPCRPurificationKit純化按照說明書進行。
芯片雜交通過將玻片放入片夾，將片夾放入染色缸，置于搖床上于室溫緩慢搖晃20~30min，甩干與干燥，將標記好的探針(Cy3/Cy5)按等量混勻(各50pmol/L),抽干后，按順序加入下列試劑：雜交緩沖液7.5μL，甲酰胺15μL，加滅菌水至總體積30μL；離心，95℃水浴5min，立刻置于冰上1min，與樣品結合，蓋上蓋玻片，42℃孵箱中16h。迅速放入另一個預先盛有200-250mL預熱至55℃的洗脫液I染色缸中，將染色缸置于搖床上于室溫緩慢搖晃20min；取出片夾，再重復洗滌，干燥。玻片完全干燥后，放入掃描片夾中，利用掃描儀(GenerationⅢarrayscanner,AmershamPharmacia)進行掃描；掃描后將圖像轉化為基于熒光強度的數字信號(Imagequant5.0;ArrayVision6.0),隨后進行數據分析和處理。