作者：王雪萍,李富軍,鄧琳,長野基子,北山喜久美,堀田博

　　目的:構建pSG5/NS5A5B△C質粒,并檢驗其在Huh7細胞中的瞬時表達。方法:使用已經構建的pTM1NS2NS5A5B△C質粒為模板,根據pTM1、HCVNS5A5B△C、pSG5序列和酶切位點特點設計引物,PCR擴增得到HCVNS5A5B△C基因片段,將目的片段插入pSG5載體中,經篩選陽性克隆、SacⅠ和BglⅡ分別酶切鑒定后,用FuGene6轉染試劑轉染入Huh7細胞。用免疫熒光染色、Westernblot檢測HCVNS5A5B△C在Huh7細胞中的表達。結果:限制性內切酶SacⅠ和BglⅡ分別酶切鑒定后,瓊脂糖凝膠電泳結果顯示酶切片段大小和插入方向均與預計一致。熒光顯微鏡下可見轉染的Huh7細胞表達帶有綠色熒光的HCVNS5A5B△C蛋白,該蛋白主要表達于細胞質,表達率達40%以上。Westernblot結果也證實在轉染pSG5/NS5A5B△C的Huh7細胞中出現了大小與HCVNS5A5B△C(82ku)一致的條帶。結論:成功構建了pSG5/NS5A5B△C質粒,并在Huh7細胞中成功瞬時表達,為進一步研究HCV蛋白的功能奠定了基礎。

丙型肝炎病毒;非結構蛋白5A5B;pSG5;Huh7細胞

　　［Abstract］AIM:ToconstructtheplasmidpSG5/NS5A5B△C,andtoinvestigateitsexpressioninHuh7cells.METHODS:TheplasmidpTM1NS2NS5A5B△Cwastakenasthetemplate.TheprimersweredesignedaccordingtothecharacteristicsofthesequenceandendoenzymecleavagesitesinHCVNS5A5B△CandvectorpTM1,pSG5.TheHCVNS5A5B△CgenefragmentwasamplifiedbyPCRfrompTM1NS2NS5A5B△CandinsertedintovectorpSG5.ThepositivecloneswerescreenedbyAmpicillinandidentifiedbytherestrictionendoenzymeSacⅠandBglⅡdigestionandagarosegelelectrophoresis.TheconstructsweretransfectedintoHuh7cellswithFuGene6reagents.ImmunofluorescenceandWesternblotwereperformedtodetecttheexpressionoftheconstructsinHuh7cells.RESULTS:Endoenzymedigestionanalysisshowedthatthesizeandtheinsertingorientationofthefragmentmetthedesignexpectation.ImmunofluorescencestainingdisplayedtheexpressionofHCVNS5A5B△Cprotein,whichwaslocatedinthecytoplasm,andtheexpressionratereachedashighas40%.SDSPAGEanalysisshowedthattherelativemolecularmassoftheexpressedproductbypSG5/NS5A5B△Cwasabout82ku,whichwasconsistentwiththetheoreticalvalue.CONCLUSION:pSG5/NS5A5B△Cissuccessfullyconstructed,anditcanbeexpressedtransientlyinHuh7cells,whichwouldlayafoundationforthefurtherstudyonfunctionofHCVpolyprotein.

　　［Keywords］hepatitisCvirus;NS5A5B;pSG5;Huh7cells

　　HCV基因組為單股正鏈RNA,核苷酸長約9.5kb,僅含一個開放閱讀框,翻譯成一個大的聚蛋白前體,由宿主細胞信號肽酶和病毒蛋白酶加工成多個成熟蛋白。其中非結構蛋白NS3的相對分子質量（Mr）為70000,有絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性［1］,參與聚蛋白前體加工和RNA復制過程。NS3絲氨酸蛋白酶位于NS3的N末端1/3處,相應于HCV多蛋白aa1027至1207,同非結構蛋白NS4A形成穩定的二聚體［2,3］,它以順式方式催化NS3NS4A裂解,反式方式催化NS4ANS4B,NS4BNS5A和NS5ANS5B裂解。我們既往構建了表達不同氨基端二級結構亞型HCVNS3/4A的多個點突變質粒,發現某些亞型與其他亞型相比NS3順式絲氨酸蛋白酶活性較弱（另文發表）。本研究中,我們擬構建NS3絲氨酸蛋白酶反式催化底物HCVNS5A5B表達質粒pSG5/NS5A5B△C,為進一步研究不同二級結構亞型的NS3反式絲氨酸蛋白酶活性奠定基礎。

　　1材料和方法

　　1.1材料pTM1NS2NS5A5B△C質粒為本室構建［4］;Huh7細胞由本室保存。質粒抽提試劑盒購自Promega公司。DMEM培養基、胎牛血清購自日水制藥株式會社。FuGene6轉染試劑盒購自RocheDiagnosticsCorp。AntimouseIgGFITC購自MedicalBiologicalLaboratoriesCO.,Ltd。鼠NS5A單克隆抗體(mAb)為Chemicon公司產品。引物由InvitrogenCorporation合成。限制性內切酶SacI,BglⅡ等試劑購自日本Toyobo公司。主要儀器:CO2培養箱（3141,IRThermoForma）;熒光顯微鏡(BX51TRF,Olympus)。

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因的擴增以既往構建的pTM1NS2NS5A5B△C質粒為模板［4］,使用PCR技術擴增NS5A5B△C片段。由于載體pTM1和pSG5中都含有SacⅠ酶切位點,而5A5B△C片段中沒有此酶切位點,根據HCVNS5A5B△C序列設計擴增引物,引入SacⅠ酶切位點(斜體),引物由InvitrogenTMLifeTechnology合成:上游引物:GATCGAGCTCGCCATGTCCGGCTCGTGGCTCAG;下游引物:GTTCGAGCTCCTATGCAGAGGCCTTCAAG。反應體系如下:10×pfuDNA聚合酶Buffer5μL,10mmol/LdNTP1μL,上游引物2.5μL（10pmol/μL）,下游引物2.5μL（10pmol/μL）,質粒模板DNA1μL（20ng）,pfuDNA聚合酶0.5μL,補水至50μL。瞬時離心混勻,放入PCR熱循環儀,按以下反應條件進行PCR反應:94℃溫育2min,94℃變性1min,50℃退火1min,72℃延伸5min,30個循環后,再72℃延伸10min。反應完畢后,取1μLPCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。試劑盒純化PCR產物。

　　1.2.2酶切和連接將NS5A5B△C和pSG5用SacⅠ限制性內切酶分別消化。酶切體系分別如下:NS5A5B△C25μL,10×buffer5μL,SacⅠ3μL,補水至50μL;pSG54μL（0.7g/L）,10×buffer5μL,SacⅠ3μL,補水至50μL。分別于37℃反應3.5h。反應完畢后,各取1μL酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。與預期吻合后,酶切產物行瓊脂糖凝膠電泳,試劑盒（QIAEXⅡAgaroseGelExtractionKit）回收靶片段。保存于-20℃備用。對經過酶切的載體pSG5行脫磷酸化處理。然后對二者進行連接,根據NS5A5B△C的大小,確定二者比例為1∶5。連接體系:NS5A5B△C8μL,pSG51μL,2×LigationMix9μL,置16℃反應15min,同時以去離子水代替NS5A5B△C片段,設立陰性對照。

　　1.2.3轉化感受態細胞及克隆擴增將連接產物轉化大腸桿菌DH5感受態細胞,鋪在有氨芐青霉素抗性的LB平板上,37℃培養16h。挑取單菌落,擴大培養并提取質粒。質粒提取、純化均參照試劑盒說明進行。

　　1.2.4重組質粒的酶切鑒定用限制性內切酶SacⅠ和BglⅡ分別對提取的質粒做酶切鑒定。酶切體系如下:質粒1μL（1μg）,SacⅠ1μL（10U）,10×LowBuffer1.5μL,補水至15μL;質粒1μL（1μg）,BglⅡ1μL（10U）,10×HighBuffer1.5μL,補水至15μL,37℃水浴進行酶切2h。酶切產物在瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

　　1.2.5Huh7細胞的培養和質粒轉染Huh7細胞于37℃,50mL/LCO2條件下用用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養,細胞長滿后傳代,之后每2d傳代1次。取傳代4次以上的細胞,按FuGene6轉染試劑操作步驟轉染質粒。

　　1.2.6免疫熒光檢測HCVNS5A5B△C的表達轉染細胞孵育48h后,棄去培養液,PBS洗10min×3次,用40g/L的多聚甲醛室溫固定10min,PBS洗10min×3次,1mL/L非離子型表面活性劑TritonX100透化處理10min,PBS洗滌10min×3次,與鼠抗NS5AmAb室溫孵育1h,PBS洗滌10min×3次,與FITC標記的羊抗鼠IgG避光室溫孵育1h,PBS洗滌10min×3次,封片,熒光顯微鏡下觀察。

　　1.2.7Westernblot檢測HCVNS5A5B△C的表達轉染細胞孵育48h后,棄去培養液,PBS洗10min×3次,裂解細胞,100℃熱休克5min,行80g/L的SDSPAGE電泳,轉膜。50g/L脫脂奶粉37℃孵育1h,加入一抗（鼠抗NS5AmAb）,37℃孵育1h,PBS洗滌15min×3次,辣根過氧化酶標記的抗鼠二抗,37℃孵育1h,PBS洗滌15min×3次,增強發光顯影。

　　2結果

　　2.1目的基因的擴增以pTM1NS2NS5A5B△C為模板,擴增出約2244bp的基因片段,與HCVNS5A5B△C大小一致（圖1）。

　　圖1PCR擴增HCVNS5A5B△C基因（略）

　　Fig1PCRamplificationofHCVNS5A5B△Cgene

　　1:λ/HindⅢDNAmarker;2:HCVNS5A5B△C.

　　2.2重組質粒的酶切鑒定轉化的菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上,連接產物平板上長出數十個菌落。陰性對照未見菌落生長。挑取單菌落,擴大培養并提取質粒。經限制性內切酶SacⅠ和BglⅡ分別酶切鑒定后,結果顯示酶切片段大小和插入方向均與預計值一致。確定pSG5/NS5A5BΔC質粒構建成功（圖2）。

　　圖2pSG5/NS5A5BΔC質粒的酶切鑒定（略）

　　Fig2IdentificationofpSG5/NS5A5BΔCbyendoenzymedigestion

　　1:pSG5/NS5A5B△C/SacI;2:pSG5/NS5A5B△C;3,4:λ/HindⅢDNAmarker;5:φ×174/HaeⅢDNAmarker;6:pSG5/NS5A5B△C/BglⅡ.